Fluorescein isotiocianato , comumente referido como FITC - pronuncia-se " encaixam -c," para rimar com " ditsy " - é um marcador fluorescente que é quimicamente ligado ou conjugado, a outras moléculas , como proteínas e anticorpos. Um anticorpo conjugado com FITC pode também ser referido como um " anticorpo marcado com FITC . " FITC é excitado pela luz em um comprimento de onda de 488 nm e emite energia fluorescente detectado a 530 nm. Um cientista pode vê-lo com um microscópio ou uso de equipamentos fluorescente que detecta as emissões fluorescentes e registra -los. Métodos

FITC conjugação segue um protocolo básico. Por exemplo , FITC e um anticorpo que ser misturados numa certa proporção em um tubo de ensaio e rodado à temperatura ambiente durante uma hora . Para remover a FITC não ligado a partir da solução , que é vertida numa coluna de cromatografia de afinidade - um tubo de vidro preenchido com um gel de rebordo semelhante a que se ligam ao FITC não conjugada . Enquanto isso , o anticorpo marcado com FITC fluirá através da coluna e é recolhida para uso .

Considerações

Antes de iniciar a conjugação, o pesquisador deve considerar vários pontos. Primeiro , FITC é altamente instável e não deve ser exposto a luz - que devem ser mantidos em tubos cobertos com folha de alumínio em todas as vezes . Em segundo lugar , o tempo de conjugação e a temperatura pode ter que ser modificado para uma proteína sensível à temperatura . Finalmente, diferentes proteínas e anticorpos podem ter diferentes capacidades de FITC - ligação, de modo a encontrar a proporção correta de anticorpos para FITC é crítico; muito pouco FITC faz um anticorpo indetectável e em excesso pode alterar a sua especificidade. Por esta razão , as conjugações preliminares em pequena escala , em diferentes rácios de FITC a anticorpo deve ser configurado em paralelo . Uma vez que a proporção ideal é estabelecida, a conjugação de grande escala pode ser realizada.
Usa

Médicos e cientistas usam anticorpos marcados com FITC , hormônios e crescimento factores em uma ampla variedade de ensaios e aplicações. Por exemplo , uma célula-tronco encontradas no sangue tem uma molécula na superfície chamado CD34 . Um técnico de laboratório pode misturar o sangue de um paciente com um anticorpo marcado com FITC específico para CD34 , e executar as células por meio de um citómetro de fluxo, que utiliza um feixe de laser para que a fluorescência FITC . Em seguida, o citômetro separa as células CD34 fluorescentes do resto das células do sangue , e os médicos podem usar essas células-tronco isoladas para tratamentos terapêuticos .